FRET പെപ്റ്റൈഡ് സാങ്കേതികവിദ്യ

ഫ്ലൂറസെൻസ് റിസോണൻസ് എനർജി ട്രാൻസ്ഫർ (FRET)

ഫ്ലൂറസെൻസ് റെസൊണൻസ് എനർജി ട്രാൻസ്ഫർ (FRET) ഒരു നോൺ-റേഡിയേറ്റിവ് ഊർജ്ജ കൈമാറ്റ പ്രക്രിയയാണ്, അതിൽ ദാതാവിന്റെ ആവേശകരമായ അവസ്ഥയിലെ ഊർജ്ജം ഇന്റർമോളിക്യുലാർ ഇലക്ട്രിക് ദമ്പതികളുടെ ഇടപെടലിലൂടെ സ്വീകരിക്കുന്ന ആവേശകരമായ അവസ്ഥയിലേക്ക് മാറ്റുന്നു.ഈ പ്രക്രിയയിൽ ഫോട്ടോണുകൾ ഉൾപ്പെടുന്നില്ല, അതിനാൽ ഇത് വികിരണമല്ല.ഈ വിശകലനത്തിന് വേഗതയേറിയതും സെൻസിറ്റീവും ലളിതവുമായ ഗുണങ്ങളുണ്ട്.

FRET പരിശോധനയിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന ചായം സമാനമായിരിക്കും.എന്നാൽ മിക്ക ആപ്ലിക്കേഷനുകളിലും, വ്യത്യസ്ത ചായങ്ങൾ യഥാർത്ഥത്തിൽ ഉപയോഗിക്കുന്നു.ചുരുക്കത്തിൽ, ദാതാക്കളുടെ ഗ്രൂപ്പ് ആവേശഭരിതരാകുമ്പോൾ, ദാതാവിൽ നിന്ന് (ഡൈ 1) സ്വീകർത്താവിലേക്ക് (ഡൈ 2) ഒരു ജോടി ദ്വിധ്രുവങ്ങൾ കൈമാറ്റം ചെയ്യുന്നതാണ് തിളക്കമുള്ള അനുരണന ഊർജ്ജത്തിന്റെ കൈമാറ്റം.പൊതുവേ, ഡോണർ ഫ്ലൂറോഫോർ ഗ്രൂപ്പിന്റെ എമിഷൻ സ്പെക്ട്രം അക്സെപ്റ്റർ ഗ്രൂപ്പിന്റെ ആഗിരണം സ്പെക്ട്രവുമായി ഓവർലാപ്പ് ചെയ്യുന്നു."രണ്ട് ഫ്ലൂറോഫോറുകൾ തമ്മിലുള്ള ദൂരം അനുയോജ്യമാകുമ്പോൾ (10 - 100 എ), ദാതാവിൽ നിന്ന് സ്വീകരിക്കുന്നയാളിലേക്ക് ഫ്ലൂറോഫോർ ഊർജ്ജം കൈമാറുന്നത് നിരീക്ഷിക്കാവുന്നതാണ്."ഊർജ്ജ കൈമാറ്റ രീതി റിസപ്റ്ററിന്റെ രാസഘടനയെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു:

1. തന്മാത്രാ വൈബ്രേഷനായി പരിവർത്തനം ചെയ്യപ്പെടുന്നു, അതായത്, ഊർജ്ജ കൈമാറ്റത്തിന്റെ തിളക്കമുള്ള പ്രകാശം അപ്രത്യക്ഷമാകുന്നു.(റിസെപ്റ്റർ ഒരു പ്രകാശം ശമിപ്പിക്കുന്നതാണ്)

2. ഉദ്വമനം റിസപ്റ്ററിനേക്കാൾ തീവ്രമാണ്, അതിന്റെ ഫലമായി ദ്വിതീയ ഫ്ലൂറസെൻസ് സ്പെക്ട്രത്തിൽ ഒരു ചുവപ്പ് ഷിഫ്റ്റ് സംഭവിക്കുന്നു.(റിസെപ്റ്ററുകൾ തിളങ്ങുന്ന എമിറ്ററുകളാണ്).

ദാതാക്കളുടെ ഗ്രൂപ്പും (EDANS) സ്വീകരിക്കുന്ന ജീനും (DABCYL) എച്ച്ഐവി പ്രോട്ടീസിന്റെ സ്വാഭാവിക അടിവസ്ത്രവുമായി ഒരേപോലെ ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് വിച്ഛേദിക്കാത്തപ്പോൾ, DABCYL ന് EDANS-നെ ഇല്ലാതാക്കുകയും പിന്നീട് ഫ്ലൂറിൻ കണ്ടെത്താനാകാതെ വരികയും ചെയ്യും.HIV-1 പ്രോട്ടീസ് വിച്ഛേദിക്കുമ്പോൾ, DABCYL വഴി EDANS ശമിപ്പിക്കില്ല, തുടർന്ന് EDANS luciferases കണ്ടെത്താനാകും.EDANS-ന്റെ ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രതയിലെ മാറ്റങ്ങളിലൂടെ പ്രോട്ടീസ് ഇൻഹിബിറ്ററുകളുടെ ലഭ്യത നിരീക്ഷിക്കാവുന്നതാണ്.

പെപ്റ്റിഡേസിന്റെ അവ്യക്തത പഠിക്കുന്നതിനുള്ള സൗകര്യപ്രദമായ ഉപകരണങ്ങളാണ് FRET പെപ്റ്റൈഡുകൾ.അതിന്റെ പ്രതിപ്രവർത്തന പ്രക്രിയ തുടർച്ചയായി നിരീക്ഷിക്കാൻ കഴിയുന്നതിനാൽ, എൻസൈമിന്റെ പ്രവർത്തനം കണ്ടുപിടിക്കുന്നതിനുള്ള സൗകര്യപ്രദമായ രീതി ഇത് നൽകുന്നു.ദാതാവ്/സ്വീകരിക്കുന്നയാൾ പെപ്റ്റൈഡ് ബോണ്ടുകളുടെ ജലവിശ്ലേഷണത്തിന് ശേഷം ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്ന ഷീൻ നാനോമോളാർ സാന്ദ്രതയിൽ എൻസൈം പ്രവർത്തനത്തിന്റെ അളവ് നൽകുന്നു.FRET പെപ്റ്റൈഡ് കേടുകൂടാതെയിരിക്കുമ്പോൾ, ആന്തരിക ഫ്ലാഷിന്റെ പെട്ടെന്നുള്ള അപ്രത്യക്ഷമാകൽ അത് കാണിക്കുന്നു, എന്നാൽ ദാതാവിന് / സ്വീകരിക്കുന്നയാൾക്ക് എതിർവശത്തുള്ള ഏതെങ്കിലും പെപ്റ്റൈഡ് ബോണ്ട് തകരുമ്പോൾ, അത് ഒരു ഫ്ലാഷ് പുറപ്പെടുവിക്കുന്നു, അത് തുടർച്ചയായി കണ്ടെത്താനും എൻസൈമിന്റെ പ്രവർത്തനം അളക്കാനും കഴിയും.